CONTRACT Nr. 8/07.10.2005
EVALUAREA GENOFONDULUI SPECIILOR DE PEUCEDANUM (FAM. APIACEAE) DIN TRANSILVANIA ÎN SCOPUL UTILIZĂRII LOR DURABILE ÎN FITOTERAPIE
Acronim: ECOPEDTERA
REZUMAT
În prezentul proiect se propune identificarea unor principii active valoroase din plante medicinale aparţinând genului Peucedanum din Transilvania în scopul utilizării lor ca materie primă pentru realizarea unor preparate medicamentoase utilizabile în tratarea unui spectru larg de afecţiuni. Investigarea genofondului natural autohton al speciilor de Peucedanum, se va face prin studii complexe de corologie, ecologie, bioproductivitate, coroborate cu rezultatele obţinute prin metode biochimice, toxicologice şi cele de biologie moleculară. Cercetările preconizate vor elucida întregul spectru de probleme privind cunoaşterea acestui grup de plante oficinale. În plus, astfel de investigaţii vor permite stabilirea legăturilor filogenetice şi corelarea caracterelor morfo-anatomice şi biochimice (biosinteza metaboliţilor secundari) cu cele ale polimorfismului genetic, elucidând astfel toate aspectele taxonomice în cadrul genului. De asemenea, micropropagarea in vitro a speciilor oficinale considerate rare sau periclitate va conduce la realizarea de culturi intensive şi la conservarea genofondului floristic. Realizarea acestor studii va contribui la dezvoltarea cercetării româneşti în scopul valorificării durabile a resurselor vegetale naturale în fitoterapie şi la consolidarea unei poziţii competitive a ştiinţei românesti pe plan internaţional, ceea ce ne va facilita participarea în viitor la Programul Cadru 7 al UE. Obiectivele proiectului sunt în concordanţă cu obiectivele programului şi cu ariile tematice 2.1. 2.3. şi 11, iar proiectul se încadrează la Platforma tehnologică PT.19 – Plante pentru viitor, având în vedere că din unele specii de Peucedanum din Asia s-au obţinut produse farmaceutice cu o largă arie de aplicabilitate în tratarea mai multor maladii (cancer, boli de inimă, acţiuni antimicrobiene etc.). Deoarece în România astfel de cercetări sunt încă într-un stadiu incipient şi au fost orientate cu precădere spre identificarea principiilor farmacologic active (numai la două specii de Peucedanum), se impune lărgirea şi completarea ariei acestor cercetări prin luarea în studiu a tuturor speciilor de Peucedanum din din Transilvania
OBIECTIVE GENERALE
Efectuarea de studii complexe pentru evaluarea fondului genetic al speciilor de Peucedanum din Transilvania, în scopul cunoaşterii aprofundate a corologiei, ecologiei şi bioproductivităţii speciilor spontane precum şi pentru caracterizarea lor morfofiziologică, biochimică şi moleculară, în vederea obţinerii de extracte utilizabile fitofarmaceutic, în concordanţă cu cercetările similare care se realizează în străinătate, pe plan european şi internaţional. În acest sens, studiile vizează şi aspecte privind efectele benefice pe care le pot avea aceste extracte asupra organismului animal bolnav. Cercetările privind inducerea embriogenezei somatice şi de crioconservare a embrionilor la speciile de Peucedanum, vor contribui deopotrivă la consolidarea metodelor de realizare a culturilor intensive ale acestor specii, precum şi la protecţia speciilor oficinale, rare şi periclitate din regiune.
ETAPELE PROIECTULUI
Anul 2005
Elaborarea unui studiu complex privind metodele moderne de investigare a plantelor medicinale (ecologice, fiziologice şi de multiplicare in vitro) Participanti: ICB Cluj-Napoca (Coordonator – CO);
Anul 2006
Studii corologice şi evaluarea potenţialului productiv al populaţiilor speciilor oficinale de Peucedanum din Transilvania şi caracterizarea morfoanatomică şi fizilogică a acestor specii; extragerea metaboliţilor secundari din biomasa vegetală a acestor specii Participanti: ICB Cluj-Napoca (Coordonator – CO); UMF Iuliu Hatieganu Cluj-Napoca (Partener 3 )
Anul 2007
Determinarea calitativă şi cantitativă a compuşilor farmacologic activi din speciile de Peucedanum şi identificarea efectului acestor extracte asupra organismelor vegetale şi animale Participanti: ICB Cluj-Napoca (Coordonator – CO); INCSB Bucuresti (Partener P2a); INCSB –Filiala CCB Stejarul Piatra Neamt (Partener P2b); UMF Iuliu Hatieganu Cluj-Napoca (Partener 3 ); USAMV Cluj-Napoca (Partener 5)
Anul 2008
Determinarea polimorfismului genetic şi a markerilor moleculari şi enzimatici ce caracterizează populaţiile de Peucedanum din Transilvania; micropropagarea in vitro prin embrioni somatici; realizarea de produse finite (tincturi, comprimate, unguente) obţinute din specii de Peucedanum în scopul predării lor către beneficiari Participanti: Participanti: ICB Cluj-Napoca (Coordonator – CO); UMF Iuliu Hatieganu Cluj-Napoca (Partener 3 ); UBB Cluj-Napoca (Partener 4); ICAS Bucuresti (Partener 6)
Conducător de Proiect
Institutul de Cercetări Biologice Cluj-Napoca, Republicii nr. 48, jud. Cluj, cod postal 400015;
telefon 0264-591238, fax 0264-591238,
E-mail: icb@cluj.astral.ro
Director
Dr. Gheorghe COLDEA
COMPONENŢA CONSORŢIULUI
Denumirea institutiei (organizatiei) participante/adrese Rolul institutiei (organizaţiei) in cadrul proiectului
Institutul de Cercetări Biologice Cluj-Napoca, filiala a INCDSB Bucuresti (ICB Cluj-Napoca) Cluj-Napoca, Str.Republicii Nr.48, Cod 400015
Conducător proiect (CO – P1)
Institutul Naţional de Cercetare Dezvoltare Stiinte Biologice Bucureşti (INCDSB Bucuresti) Sector 6, Splaiul Independentei, Nr. 296, Cod 060031
Partener 2a (P-2a)
Institutul Naţional de Cercetare Dezvoltare Stiinte Biologice Bucureşti – Staţiunea de Cercetări Stejarul Piatra-Neamţ str. Alexandru cel Bun, nr. 6, cod postal 640001
Partener 2b (P-2b)
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu”, Fac. de Farmacie Cluj-Napoca (UMF “Iuliu Hatieganu” Cluj-Napoca) Str. Emil Isac nr. 13, Cod 400023
Partener 3 (P3)
Universitatea Babeş-Bolyai, – Facultatea de Biologie-Geologie, Cluj-Napoca (UBB Cluj-Napoca) Str. Kogalniceanu nr.1 Cod 400084
Partener 4 (P4)
Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară – Facultatea de Medicină Veterinară, Cluj-Napoca (USAMV Cluj-Napoca) Str. Manastur, 3-5, Cod 400372
Partener 5 (P5)
Institutul de Cercetări şi Amenajări Silvice (ICAS), Bucureşti Şos. Ştefăneşti, nr. 128
Partener 6 (P-6)
Finanţare: Buget de Stat – Ministerul Educaţiei, Cercetării şi Tineretului, Programul : CERCETARE DE EXCELENTA
Categoria de proiect: Modul I, P-CD, BIOTECH Aria tematică D6
Autoritatea Contractantă:
Centrul National de Management Programe Bucuresti (CNMP Bucuresti)
Durata proiectului: 36 luni (03.10.2005 – 30.09.2008)
Activitatile si responsabilitatile aferente fiecarui participant;
Denumirea organizaţiei/responsabil
Activitati/responsabilitati
ICB Cluj-Napoca
Director de proiect
CS I Dr. Deliu Constantin
e-mail: deliu_konstantin@yahoo.com
Cercetări de ecologie, fiziologie vegetală şi animală, biochimie, biologie celulară şi moleculară, culturi vegetale in vitro. Monitorizarea proiectului; Intocmirea si predarea rapoartelor anuale (pe faze) si a raportului final la beneficiar (CNMP Bucuresti) – Publicarea de lucrari
INCDSB Bucuresti
Partener – 2a
Responsabil proiect
Prof. Dr. Gabriel Lucian Radu,
e-mail: gl_radu@dbio.ro
Cercetări biochimice aprofundate, dozări cantitative si calitative a unei game largi de compuşi organici prin HPLC, din diverse extracte – Intocmirea si predarea rapoartelor partiale; Publicarea de lucrari
INCDSB Bucuresti Filiala CCB Stejarul Piatra Neamţ
Partener – 2b
Responsabil proiect
CSI. Dr.Gille Elvira,
e-mail: elgille9@yahoo.com
Metodologia testării fitobiologice (toxicologice) a extractelor naturale Tipuri de extractie. Teste citogenetice/morfometrice. – Intocmirea si predarea raportului partial; Publicarea de lucrari
UMF “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca
Partener – 3
Responsabil proiect
Prof. Dr. Tămaş Mircea
e-mail: mtbotanica@yahoo.com
Cercetari fitofarmaceutice – extragerea principiilor farmacologic active si caracterizarea acestora prin dozări cantitative şi calitative ale compuşilor biologic activi – Realizarea de extracte uscate si hidroalcoolice – Intocmirea si predarea raportului partial; Publicarea de lucrari
UBB Cluj-Napoca
Partener – 4
Responsabil proiect
Sef lucr. Dr. Keul Anca,
e-mail: alkeul@yahoo.com
Utilizarea unor sisteme enzimatice pentru evidenţierea polimorfismului intraspecific şi identificarea polimorfismului intrapopulaţional. Utilizarea izoenzimelor şi a proteinelor de depozit din seminte pentru discrimarea speciilor– Intocmirea si predarea raportului partial; Publicarea de lucrari
USAMV Cluj-Napoca
Partener – 5
Responsabil proiect
Asistent Dr. Sevastre Bogdan
e-mail: sevastre_b@mail.com
Metodologiile de investigare ale acţiunii unor extracte vegetale asupra unor procese patologice la animale de laborator – Intocmirea si predarea raportului partial; Publicarea de lucrari
ICAS Bucureşti
Partener – 6
Responsabil proiect
Ing. Dr. Poescu Flaviu,
e-mail: flaviu.popescu@rdslink.ro
Studii de genetică moleculară în scopul evidenţierea unor markeri moleculari care să caracterizeze atât diversitatea genetică intra- şi interpopulaţională, cât şi descrierea unor markeri moleculari caracteristici potenţialului productiv de metaboliţi secundari bogaţi în principii active.
BUGETUL PROIECTULUI
Valoarea proiectului (include şi alte surse atrase) 741.000 lei
Valoarea contractului (sursa numai buget de stat): 741.000 lei
Director de Proiect
Dr. Constantin DELIU cerc.st. I; e-mail: deliu_konstantin@yahoo.com
PLAN DE REALIZARE A PROIECTULUI
Anul
Etape/ Activităţi/ Parteneri
Termene
Rezultate/
Documente de prezentare a rezultatelor
Necesar resurse financiare *)
(Valoare) in RON
Categorii de cheltuieli conform HG 1579/2002**)
Valoare in RON
Total
Din care
Finanţare
din buget program
Finanţare
din alte surse
(cofinanţare)
Din bugetul programului
Din alte surse
(cofinanţare)
2005
Etapa I – Fundamentarea metodologiilor de investigare a plantelor medicinale
03.Oct 2005
A.1. Aspecte teoretice privind : 1.metode de cercetare ecologica. 2. metodele de investigare fiziologica. 3. metodele de clonare in vitro
Predare 5 dec 2005
Se va elabora un studiu complex privind metodele moderne de investigare a plantelor medicinale
35.000
35.000
35.000
CO- P1 ICB Cluj
Raport de prezentare a rezultatelor cercetarii
2006
Etapa II – Cunoaşterea corologiei, ecologiei şi a potenţialului productiv al speciilor de Peucedanum din Transilvania
ian.-oct. 2006
A.1.1. Inventarierea şi caracterizarea ecologică a speciilor de Peucedanum; 2. evaluarea potenţialului lor productiv; 3. prelevarea de material vegetal pentru analize biochimice si de biologie moleculara
Predare 10. oct. 2006
Elaborarea hartilor corologice si ecologice cu speciile de Peucedanum din Transilvania; stabilirea potenţialului lor productiv;
75.000
75.000
75.000
CO- P1 ICB Cluj
Raport de prezentare a rezultatelor cercetarii
Etapa IIIa Caracterizarea morfologica si fiziologica a speciilor de Peucedanum
ian-noiembrie 2006
A.1.1. Teste de germinaţie 2. Creşterea plantulelor de Peucedanum în condiţii de laborator. 3. Studii morfoanatomice şi fiziologice comparative la speciile genului Peucedanum
Predare 10 nov. 2006
Identificarea caracterelor morfologice, fiziologice si evidentierea capacitatii germinative la speciilor de Peucedanum
85.000
85.000
85.000
CO-P1 ICB Cluj
Raport de prezentare a rezultatelor cercetarii
Etapa IIIb. Stabilirea tehnologiilor optime de extractie a principiilor active din speciile oficinale de Peucedanum din Transilvania
luna iunie –noeimbrie
2006
A.1.1-1. Identificarea si selectarea solventilor pentru extractia principiilor active din speciile de Peucedanum; 2. prelucrarea extractelor vegetale sub forma de produse finite
Predare 10 nov. 2006
Obtinerea de extracte vegetale din specii de Peucedanum
36.000
36.000
36.000
CO-P1 ICB Cluj
Conducere de proiect
3.000
3.000
3.000
P-3 UMF Cluj
Raport de prezentare a rezultatelor cercetarii
33.000
33.000
33.000
2007
Etapa IV. Caracterizarea biochimică, calitativă şi cantitativă, a extractelor alcoolice din speciile de Peucedanum din Transilvania
Ianuarie-iulie 2007
A.1.1. Identificarea principiilor active de tip cumarinic si a uleiurilor volatile. 2. Elaborarea unei metode HPLC-UV de analiza a compusilor cumarinici. 3. Optimizarea parametrilor operaţionali ai metodei HPLC elaborate; Procedura de analiza. 4. Corelarea intre tehnologiile de extractie si continutul in principii active.
Predare – 10 iulie 2007
Identificarea unor principii active (derivati cumarinici si polifenolici) din extracte alcoolice. Compozitia fazei mobile, caracteristicile asociate metodei HPLC. Determinarea continutului in cumarine, polifenoli; optimizarea compozitiei sistemelor de extractie in diferiti solventi; rolul activator/ inhibitor al solventilor asupra activitatii farmacologice.
100.000
100.000
100.000
P2a INCDSB Bucuresti
Raport de cercetare; Metodă de laborator ; Articol/lucrare in publicatii nationale sau internationale;
Etapa V. Determinarea citotoxicităţii şi genotoxicitatii la extractele vegetale din specii de Peucedanum din Transilvania bogate in principii active
mart.-sept. 2007
A.1. 1. Realizarea variantelor experimentale pentru testarea extractelor vegetale; 2. evaluarea efectelor citotoxice si genotoxice pe celula vegetala (testare fitobiologica)
Predare 10 sept 2007
Tipuri de extractie. Teste citogenetice/morfometrice. Analize statistice. Ierarhizarea extractelor de Peucedanum functie de gradul de cito- si genotoxicitate
60.000
60.000
60.000
P2b INCDSB – CCB Stejarul Piatra Neamt
Raport de prezentare a rezultatelor cercetarii; publicare lucrari
Etapa VI. Actiunea extractelor vegetale din specii de Peucedanum bogate in principii active asupra unor organe vitale la animale de laborator
Apr.-oct. 2007
A.1.1. Determinarea activitatii unor enzime in organe vitale (creier, ficat, rinichi); 2. determinarea reactiei de stres la nivelul axei hipotalamo-hipofizo-suprarenale 3. evaluarea histoenzimilogica a hepatocitolizei si reactivitatii unor organe limfoide (timus, splina).
Predare 10 oct .2007
Identificarea efectelor produse de extractele vegetale din Peucedanum bogate in principii active asupra organelor endocrino-metabolice-imunitare
65.000
65.000
65.000
CO-P1 ICB Cluj
Raport de prezentare a rezultatelor cercetarii; publicare lucrari
Etapa VII. Evidentierea actiunii unor extracte vegetale din specii de Peucedanum din Transilvania bogate in principii active asupra unor procese patologice la animale de laborator
Apr.-nov. 2007
A.1. 1. Inducerea experimentală a unor procese patologice la animale de experienţă 2. Testarea efectului ameliorator al extractelor de Peucedanum
Predare 10 nov. 2007
Identificarea efectului ameliorator al extractulelor de Peucedanum în afecţiuni neoplazice, inflamatorii, imunorepresive şi dismetabolice.
50.000
50.000
50.000
P-5 USAMV Cluj
Raport de prezentare a rezultatelor cercetarii; publicare lucrari
2008
Etapa VIII. Inducerea embriogenezei somatice la specii oficinale de Peucedanum si criostocarea lor; evidenţierea diversităţii intraspecifice (polimorfism genetic) în cadrul unor populaţii de Peucedanum din Transilvania cu un conţinut ridicat de principii active
CO-P1 + P6
Ian.-iunie 2008
Predare 10 iunie 2008
A1.1. Selectarea tesuturilor in vederea multiplicarii prin embriogeneza somatica; 2. Selectarea mediilor de cultura 3. Determinarea parametrilor fiziologici la embrionii somatici 4. Realizarea criostocarii embrionilor somatici
Obtinerea de embrioni somatici la speciile rare si bogate in principii active de Peucedanum in vederea realizarii de culturi intensive si in scopul conservarii lor in natura.
85.000
85.000
85.000
CO-P1 ICB Cluj-Napoca
Raport de prezentare a rezultatelor cercetarii; publicare lucrari
A.2.Evidenţierea diversităţii intraspecifice (polimorfism genetic) în cadrul unor populaţii de Peucedanum din Transilvania cu un conţinut ridicat de principii active
A.2.1.Utilizarea tehnicilor moleculare (RFLP, RAPD) pentru identificarea si discriminare unor caractere genotipice la speciile oficinale de Peucedanum. A2.2 Evidentierea polimorfismului genetic la speciile de Peucedanum
Identificarea caracterelor genetice care determina individualizarea feno- şi ecotipurilor oficinale de Peucedanum bogate in principii active
55.000
55.000
55.000
P-6 ICAS Bucuresti
Raport de prezentare a rezultatelor cercetarii; publicare lucrari
ETAPA IX. Caracterizarea diversităţii enzimatice la speciile de Peucedanum din Transilvania cu un conţinut ridicat de principii active; Obţinerea şi caracterizarea a 2-3 extracte farmaceutice valoroase din specii de Peucedanum din Transilvania care sunt solicitate pentru valorificare de unele firme interesate
CO-P1 + P3 + P4
11.Iunie – oct. 2008 predare
30 sept 2008
A.1. Utilizarea unor seturi enzimatice pentru identificarea polimorfismului intraspecific la speciile de Peucedanum din Transilvania; 2. identificarea polimorfismului intrapopulaţional; 3. utilizarea unor indici biochimici si enzimatici in diferentierea speciilor
Estimarea variabilităţii genetice intraspecifică şi intrapopulaţională; evidentierea activitaţii metabolice intra- şi interspecifice
40.000
40.000
40.000
P-4 UBB
Raport de prezentare a rezultatelor cercetarii; publicare lucrari
A.2. Obţinerea şi caracterizarea a 2-3 extracte farmaceutice valoroase din specii de Peucedanum din Transilvania care sunt solicitate pentru valorificare de unele firme interesate
A.2. 1. Realizarea de extracte de Peucedanum bogate in principii farmacologic active 2. Caracterizarea produselor finite şi indicarea efectelor fitofarmaceutice
P-3 UMF
Obţinerea de extracte standardizate (tincturi, extracte hidroalcoolice si uscate) din Peucedanum, bogate în flavone si cumarine. Realizarea de produse farmaceutice conditionate (capsule, comprimate, unguente); Indicatii: Compozitie, mod de utilizare, efecte terapeutice
55.000
55.000
55.000
CO-P1
Conducere proiect
5.000
5.000
5.000
CO-P1 + UMF
Raport final de prezentare a rezultatelor; diseminarea rezultatelor prin publicare lucrari.
50.000
50.000
REZULTATE OBŢINUTE – REZUMAT
Ø Cercetările ecologice întreprinse în teren asupra speciilor de Peucedanum din Transilvania.
Ø Realizarea hărţilor cu răspândirea speciilor de Peucedanum din Transilvania
Ø Stabilirea potentialului bioproductiv al speciilor oficinale de Peucedanum din Transilvania
Ø Experimentele de germinaţie şi măsurătorle biometrice şi biochimice comparative efectuate asupra speciilor de Peucedanum din Transilvania
Ø Elaborarea tehnicilor cele mai adecvate de extracţie a principiilor active din Peucedanum, precum şi a metodelor analitice calitative (CSS şi HPLC) şi cantitative (HPLC – RPLC-MS)
Ø Studiile efectuate în scopul evidenţierii acţiunii extractelor realizate din unele specii de Peucedanum la nivel histologic, histochimic şi histoenzimatic care au evidenţiat ca acestea nu sunt toxice la acest nivel demonstrând că principiile bioactive din compoziţia extractelor de Peucedanum manifestă proprietăţi antioxidante;
Ø Realizarea de modele experimentale (teste şi determinări hematologice, biochimice şi măsurarea parametrilor stresului oxidativ, urmărindu-se toxicitatea acută, efectul antitumoral şi efectul antiinflamator) care au dovedit pentru speciile P. officinale şi P. oreoselinum un semnificativ efect antioxidant, iar pentru extractul de P. officinale un cert efect antiinflamator, iar testele de toxicitate nu au arătat efecte adverse, toate animale luate în studiu supravieţuind fără sa prezinte nici un semn clinic
Ø Micropropagarea in vitro a speciilor prin metoda embriogenezei somatice directe şi indirecte la P. oreoselinum şi P. longifolium precum si crioconservarea celei din urmă prin metoda incapsulării-deshidratarii
Ø Cercetările de genetică moleculară care au urmărit identificarea unor markeri moleculari pentru caracterizarea diversităţii genetice interspecifice în cadrul genului. Variabilitatea genetică a fost caracterizată cu ajutorul markerilor moleculari cloroplastici. Analiza comparativă a rezultatelor de genetică moleculară şi a celor de biochimice arată o corelaţie evidentă între structura genetică a speciilor şi conţinutul ridicat de furanocumarine, substanţe cu proprietăţi fotosensibilizante şi citostatice. Speciile cele mai bogate în principii active sunt P. longifolium şi P. officinale, specii foarte apropiate din punct de vedere al structurilor genetice şi care pot fi caracterizate prin markeri moleculari distincţi faţă celelalte specii analizate din cadrul genuluiIntocmirea de dendrograme
Ø Studiile izoenzimatice cu privire la biodiversitatea inter- şi intraspecifică a speciilor de Peucedanum din Transilvania
Ø Realizarea a următoarelor preparate:
· 1. Extractul uscat de P. oreoselinum din care s-a utilizat partea aeriană a plantei (herba) recoltată înainte de înflorire
· 2. Extract fluid realizat din extractul uscat de P. oreoselinum
· 3. Capsule operculate cu un conţinut de 0,25 g extract uscat ceea ce corespunde la 1 g produs vegetal.
S-au caracterizat fizico-chimic cele 3 produs farmaceutice. S-a analizat calitativ şi cantitativ flavonoidele din cele 3 produse şi s-a standardizat extractul uscat în 1,60% flavonoide totale exprimate în rutozidă
· 4. Furanocumarine izolate din P. officinale cu un randament de 6,62% pe care le-am caracterizat prin analize CSS şi HPLC/MS.
C ele 3 preparate: fluid, uscat şi capsule operculate (caracterizate d.p.d.v. fizico-chimic) obţinute din P. oreoselinum si bogate in flavonoide, vor trebui studiate clinic în vederea introducerii lor în terapia unor afectiuni aşa cum este enuriazisul la copii, sau a altor afecţiuni urologice. De asemenea vor trebui studiate clinic furanocumarinele izolate din P. officinale, avand in vedere multitudinea efectelor pe care le au acestea – anticoagulante, vasodilatatoare, oestrogenice, fotosensibilizante ale dermei, antimicrobiene, antioxidante, anti-HIV, antihelmintice, sedative şi hipnotice, analgezice, hipotermice, citostatice şi antitumorale. Principalii beneficiari ai acestor cercetari sunt pacienţii, medicii umani şi spitalele, oferind astfel noi alternative terapeutice cu privire la tratamentul acestor afectiuni, şi, de asemenea, reducând costurile legate de tratarea pacienţilor, optimizând totodată reintegrarea socială şi economică rapidă a acestor pacienţi
Ø Având în vedere rezultatele obţinute s-a izolat o arie de protecţie în care vegetează Peucedanum officinale – în staţiunea naturală (Viişoara, Jud. Bihor) pentru a obţine fructe mature în vederea începerii procesului de introducere în cultură, specia de Peucedanum fiind cu o mare productivitate în rădăcini bogate în furanocumarine
Ø Participari la Simpozioane, Conferinte, Congrese etc. nationale: 7
Ø Participari la Simpozioane, Conferinte, Congrese etc. internationale: 1
Ø Articole aparute in tara sau in curs de aparitie: 8
Ø Articole in curs de aparitie in strainatate: 1
REZULTATE OBŢINUTE – IN EXTENSO
Anul 2005
Etapa I
Fundamentarea metodologiilor de investigare a plantelor medicinale (lucrare bibliografică) Cercetările au fost efectuate de Conducatorul de Proiect – Institutul de Cercetari Biologice, Cluj-Napoca
Obiectivul general al proiectului constă în investigarea speciilor de Peucedanum din genofondul natural al Transilvaniei, în scopul evaluării resurselor vegetale bogate în principii biologic active şi a identificarii acestor principii valoroase care vor fi folosite fie ca materie primă în industria farmaceutică (pentru realizarea unor preparate medicamentoase utilizabile în tratarea unui spectru larg de afecţiuni), fie ca extracte standardizate.
În Flora României sunt semnalate un număr de 12 specii de Peucedanum, dintre care 10 există şi în Transilvania, specii care au fost luate în studiu în prezentul proiect (1. Peucedanum palustre (L.) Moench; 2. P. rochelianum Heuffel; 3. P. latifolium (M.B.) DC; 4. P. officinale L.;5. P. oreoselinum (L.) Moench; 6. P. carvifolium Vill.; 7. P. cervaria (L.) Cuss; 8. P. tauricum M.B.; 9. P. austriacum (Jacq.) Koch; 10. Peucedanum longifolium W. et K.)
Plantele din genul Peucedanum sintetizează mai multe grupe de substanţe active cum sunt: compuşii fenolici (acidul cafeic şi clorogenic), flavonoidele (cverceitina şi rutina), cumarinele simple (scopoletina) şi furanocumarinele (angelicina, bergaptenul, psoralenul, xantotoxina, peucedanina, etc). Compuşii fenolici şi flavonoidele au o serie de acţiuni cum sunt cele antioxidante (contribuind astfel la prevenirea bolilor cardiovasculare) antiinflamatoare, antispastice, diuretice, fiind indicate în tratamentul astmei, alergiilor, a unor afecţiuni ale prostatei, a cistitelor interstiţiale, în enurezis nocturn la copii, etc; furanocumarinele au acţiuni biologice multiple: anticoagulante, vasodilatatoare, oestrogenice, fotosensibilizante ale dermei, antimicrobiene, antioxidante, anti-HIV, antihelmintice, sedative şi hipnotice, analgezice, hipotermice, citostatice şi antitumorale.
Anul 2006
Etapa II Cunoaşterea corologiei, ecologiei şi a potenţialului productiv al speciilor de Peucedanum din Transilvania Cercetările au fost efectuate de Conducatorul de Proiect – Institutul de Cercetari Biologice, Cluj-Napoca
Cercetările ecologice întreprinse în teren asupra speciilor de Peucedanum din Transilvania au permis clarificarea aspectelor legate de cerinţele acestora faţă de principalii factori ecologici şi afinitatea lor cenotică faţă de unele comunităţi vegetale naturale. Precizările fitocenotice făcute la speciile de Peucedanum facilitează identificarea lor în teren de către studenţi, botanişti şi cercetători care lucreză în domeniul ecologiei vegetale. Hărţile corologice sunt întocmite în sistem UTM pentru fiecare specie de Peucedanum din Transilvania pe baza informaţiilor din literatura botanică, a datelor din herbarul Universităţii Babeş-Bolyai şi a noilor localităţi semnalate in acest an, oferind specialiştilor o informaţie completă asupra răspândirii lor în regiune. Cercetările cu privire la potenţialul bioproductiv al speciilor de Peucedanum demonstrază faptul că numai speciile Peucedanum oreoselinum, P.carvifolia şi P.cervaria pot fi recoltate anual fără să se pericliteze biodiversitatea din regiune.
Etapa III
IIIa: Caracterizarea morfologica şi fiziologica a speciilor de Peucedanum Cercetările au fost efectuate de catre Conducatorul de Proiect – Institutul de Cercetari Biologice, Cluj-Napoca
IIIb: Stabilirea tehnologiilor optime de extractie a principiilor active din speciile oficinale de Peucedanum din Transilvania Cercetările au fost efectuate de catre Partenerul 3 – UMF „Iuliu Hatieganu” Fac. De Farmacie, Cluj-Napoca
În urma studiilor de germinaţie, morfo-fiziologice şi biochimice au fost observate o serie de aspecte şi anume că: germinaţia seminţelor de Peucedanum atinge un maxim de cca 60-70% imediat după recoltare, dar scade treptat, stratificarea prealabilă a acestora fiind un factor benefic inducerii germinaţiei, iar măsurătorile biometrice efectuate asupra caracterelor morfologice principale la diferitele specii de Peucedanum, precum şi analizele biochimice (pigmenţi asimilatori şi proteine totale) demonstrează faptul că există diferenţe semnificative atât între speciile studiate, cât şi între indivizii aceleaşi specii care provin din populaţii ce vegetează în habitate (situsuri) diferite.
În cadrul studiilor de biochimie cu privire la extracţia şi determinarea calitativă şi cantitativă a principiilor active din diversele specii de Peucedanum au fost puse la punct mai multe metode şi tehnologii prin care au fost relevate mai multe aspecte: a) în urma analizei randamentelor de extracţie s-a propus utilizarea alcoolului de 50o ca cel mai bun solvent de extracţie (aplicând tehnica macerării la rece cu agitare mecanică) pentru obţinerea tincturilor din speciile de Peucedanum; b) pentru determinările calitative ale flavonoidelor din extracte s-a utilizat CSS, iar cantitativ spectrofotometria; pentru furanocumarine s-a folosit tehnica CSS, constatându-se că toate speciile conţin flavonoide dar în proporţii variabile, cele mai mari cantitătăţi acumulându-se în herba speciilor P. officinale şi P. longifolium; c) prin CSS furanocumarinele au fost detectate în rizomii şi rădăcinile de la 7 din cele 10 specii analizate constatându-se că fracţiunile furanocumarinice sunt bine separate. Cele mai multe furanocumarine sunt prezente în rizomii speciilor P. longifolium şi P. officinalis (în care s-a detectat şi peucedanina), dar unele dintre ele sunt nedecelabile prin ceastă tehnică la P. rochelianum, P. austriacum şi P. carvifolia;
Anul 2007
Etapa IV Caracterizarea biochimică, calitativă şi cantitativă, a extractelor alcoolice din speciile de Peucedanum din Transilvania Faza a fost executată de către Partenerul 2a – Institutul Naţional de Cercetare Dezvoltare pentru Ştiinţe Biologice Bucureşti – Centrul de Bioanaliza
Pentru desfasurarea si realizarea experimentelor prevazute in planul de realizare al fazei nr 4, anul 2007, a fost elaborata o metoda de analiza calitativa si cantitativa cromatografica (HPLC cu detector UV) pentru determinarea simultana a flavonoidelor si furanocumarinelor. In functie de rezultatele obtinute in faza precendenta (extractele hidroalcoolice de Peucedanum au fost analizate prin cromatografie in strat subtire) s-a hotarat determinarea a 4 flavonoide si a 5 furanocumarine. Cum pana in prezent nu a fost descrisa o metoda de analiza a celor 9 compusi pentru elaborarea unei metode eficiente cu caracteristici de performanta optimi a fost nevoie de efecturarea a 9 incercari. Masurarile cromatografice s-au efectuat utilizand un sistem HPLC cu detector diode array (Shimadzu) utilizanduse o coloana Nucleosil 100 C18 10 μm 25x 0.46. Lungimile de unda alese in functie de spectrele de absorbtie, pentru interpretarea rezultatelor au fost urmatoarele: 247 nm (pentru angelicin, psoralen si xantotoxin), 323 nm (pentru 5-metoxipsoralen, acid cafeic si acid clorogenic) si 354 nm (pentru quercetin, rutin si scopoletin). Timpul total de analiza a fost de 70 de minute. Din analiza cromatogramelor s-a observat urmatori timpi de retentie tR psoralen = 20.27 min., t R angelicin = 44.589.8tic min., t R xantotoxin= 45.39 min. la μ = 247 nm, t R ac clorogenic = 8 min., t R ac cafeic = 10.63 min., t R 5-metoxipsoralen = 56.8 min. la μ = 323 nm, t R scopoletin = 19.34 min., t R rutin = 20.47 min., t R quercetin =36 min. la μ = 354 nm, iar compusii pot fi determinati cu acuratete din aceeasi matrice cu o rezolutie buna. Au fost realizate masurari la concentratii diferite (12 concentratii diferite, masurarile fiind realizate in triplicat) si s-au trasat curbele de calibrare pentru cele 9 substante, care au prezentat o excelenta liniaritate intre aria si concentratia analitului injectat pe un domeniu de concentratii cuprins intre 1 μg/mL-100 μg /mL, coeficientii de corelatie fiind de R> 0.9997 (pentru toti compusi).Datele obtinute confirma faptul ca metoda poate fi folosita pentru determinarea prin cromatografie lichida de inalta performanta cu detectie UV a acidului clorogenic, acidului cafeic, scopoletin, psoralen, rutin, quercetin, angelicin, xantotoxin si 5-metoxipsoralen. Extractele in alcool metilic 5% din HERBA (partea aeriana a plantelor) din specii de Peucedanum din Transilvania, au fost analizate prin cromatografie de lichide (HPLC) si s-a folosit metoda descrisa mai sus. Analiza furanocumarinelor s-a realizat prin HPLC cu detector UV folosindu-se metoda nou dezvoltata. Deoarece metoda permite determinarea simultana si a flavonoidelor s-a realizat si acest lucru.
Etapa V Determinarea citotoxicităţii şi genotoxicitatii la extractele vegetale din specii de Peucedanum din Transilvania bogate in principii active Faza executată de către Partenerul 2b – Institutul Naţional de Cercetare Dezvoltare pentru Ştiinţe Biologice Bucureşti – Centrul de Cercetari Biologice “Stejarul” Piatra Neamt
In aceasta etapa studiile au vizat determinarea efectelor citotoxice sau genotoxice a unor extracte vegetale (tincturi 70%) obtinute din 4 specii de Peucedanum si a furanocumarinelor izolate din rizomul de Peucedanum officinale. S-a analizat fitochimic materialul vegetal obtinut in urma testarii fitobiologice a extractelor, material constituit din radacini si tulpini (plantule de Triticum aestivum).
Testele fitobiologice aplicate unui sistem vegetal, respective grau (Triticum aestivum L.), in urma tratamentului cu tincuri de Peucedanum au evidentiat urmatoarele:
Testul aberatiilor cromosomiale in ana-telofazele meristemului radicular (punti, fragmente, micronuclei, apoi cromosomi retardatari, anafaza dezorganizate), nu a relevat un efect genetic clastogen (genotoxic) demn de luat in considerare. La variantele experimentale frecventa celulelor cu aberatii cromosomiale a oscilat intre 2,87 – 2,91% la var. 0,1% extract 70% furanocumarine din P. officinale si 4-3 (tinctura de P. cervaria), si 4,47% la 1% tinctura de P. palustre (la control 3,10% ana-telofaze aberante.
Testele fitobiologice efectuate pe Triticum aestivum L., in urma tratamentelor cu tincturi de Peucedanum, au relevat unele efecte citotoxice (efecte inhibitoare ale proceselor de germinare a cariopselor si crestere a plantutelor) mai ales in cazul tincturii de P. oreoselinum si partial a celei de P. palustre; asemenea efecte au fost mai putin evidente pentru tinctura si extractul furanocumarinic din P. officinale. Testul citogenetic nu a remarcat un efect clastogen (genotoxic) semnificativ, cel putin pe un sistem vegetal (grau), si in conditiile experimentului de fata; abaterile de 1-2% ale procentului de celule meristematice radiculare de grau cu aberatii cromosomiale, fata de control, nu le consideram ca fiind semnificative. Referitor la toate efectele biologice analizate, subliniem faptul ca, in general, nu s-a putut desprinde o relatie clara doza (concentratie) – efect biologic inregistrat (de multe ori efectul biologic avea valori mai mari comparativ, cu controlul, la 1% tinctura, fata de 0,1% tinctura).
Analiza fitochimica calitativa a materialului vegetal obtinut in urma tratamentului cu tincturi de Peucedanum in concentratii diferite, a evidentiat in extractele de grau prezenta unor fractiuni polifenolice si flavonoidice de tip acid cafeic, clorogenic, ferulic, rutozida si uneori luteolina. Prezenta unor fractiuni furanocumarinice in extractele de grau atesta influenta acestora asupra metabolismul propriu la nivelul radacinilor si tulpinilor de grau.
Etapa VI Actiunea extractelor vegetale din specii de Peucedanum bogate in principii active asupra unor organe vitale la animale de laborator Cercetările au fost efectuate de catre Conducatorul de Proiect – Institutul de Cercetari Biologice, Cluj-Napoca
In scopul realizarii etapei s-au utilizat unele metode biochimice, histologice şi histoenzimologice pentru a putea aprecia efectele celor 4 specii din genul Peucedanum asupra unor organe vitale sau importante la animale de laborator. Astfel, cu metode biochimice s-au determinat următorii parametri: nivelul activităţii transaminazelor serice (GPT şi GOT) pentru a putea aprecia existenţa sau nu a unui proces de hepatocitoliză; determinarea ratei de lipidperoxidare în creier, ficat şi rinichi; estimarea grupărilor sulfhidril (SH) în creier şi rinichi; dozarea concentraţiei colesterolului în glandele suprarenale. Cu ajutorul metodelor histologice (coloraţia hematoxilin-eozină, Gabe-Davson, pentru neorosecreţie şi Hurduc, pentru hipofiză, s-a putu aprecia structura tuturor organelor recoltate.Cu ajutorul metodelor histoenzimologice s-au analizat aspecte metabolice generale şi specifice în organe vitale şi importante. Astfel, s-a determinat activitatea următoarelor enzime: în creier (monoaminooxidaza, citocromoxidaza, adenozintrifosfataza); în glandele suprarenale (steroiddehidrogenaza, glucozo-6-fosfatdehidrogenaza, lactatdehidrogenaza); în ficat, rinichi, timus, splină (lactatdehidrogenaza, succinatdehidrogenaza, citocromoxidaza, adenozintrifosfataza). Am urmărit în acest experiment procesul de hepatocitoliză (prin determinarea transaminazelor GPT şi GOT) situaţia axului hipotelamo-hipofizo-suprarenalian pentru aprecierea unei eventuale stări de stress, precum şi reactivitatea unor organe metabolice vitale ca ficatul şi rinichii precum şi a unor organe limfoide ca timusul şi splina. Rezultatele noastre, bazate pe un complex de metode, descoperă anumite modificări la nivelul parametrilor analizaţi. Cele mai importante rezultate arată că, transaminazele nu cresc, deci nu se produce hepatocitoliză. Rata de peroxidare lipidică scade la loturile P. officinale, P. palustre şi P. cervaria, iar radicalii SH cresc la aceleaşi loturi în general. Scăderea fenomenului de lipoperoxidare şi menţinerea unei concentraţii crescute de grupări sulfhidril (în principal gşutation), ne demonstrează că principiile bioactive din compoziţia extractelor de Peucedanum manifestă proprietăţi antioxidante celulare, prevenind apariţia fenomenelor de lipoperoxidare şi menţinând o concentraţie crescută de grupări sulfhidril în celule. Cele mai semnificative rezultate s-au obţinut la loturile P. officinale, P. palustre şi P. cervaria. Analiza axei hipotalamo-hipofizo-suprarenaliană nu a permis evidenţierea unei stări de stress. Activitatea enzimatică în ficat şi rinichi, prezintă o creşre moderată a lactatdehidrogenazei, succinatdehidrogenazei şi citocromoxidazei la loturile P. officinalle şi P. palustre. Organele limfoide nu se modifică, deci nici starea imunologică. Compoziţia complexă cu flavonoide şi cumarine ar putea determina modificările arătate. Concluzii: Tratamentul cu extracte de Peucedanum evidenţiază: nu este hepatocitoliză; nu se induce stare de stress; scăderea lipoperoxidării şi creşterea grupărilor SH, adică capacitate crescută antioxidantă (antiradicali liberi); creşterea moderată a activităţii unor enzime oxidoreducătoare în ficat şi rinichi; nu se influenţează starea imunitară; extractele de P. officinale, P. palustre şi P. cervaria sunt cele mai reactive (eficiente); aceste extracte de Peucedanum (4) nu manifestă toxicitate în experimentele pe animale şi crează premize favorabile pentru cercetări ulterioare, dovedind calităţi antioxidante.
Etapa VII Evidenţierea acţiunii unor extracte vegetale din specii de Peucedanum din Transilvania bogate in principii active asupra unor procese patologice la animale de laborator Faza executată de către Partenerul 5 – USAMV Cluj-Napoca
Plantele încadrate în ordinul Peucedanum conţin o largă gamă de substanţe active, numeroase din ele cu valoarea terapeutică, cele mai importante fiind reprezentate de polifenoli, o categorie amplă de compuşi care includ pigmenţii flavonoidici şi cumarinele. Cercetări efectuate pe specii de Peucedanum din diferite arii geografice au pus în evidenţă o serie de efecte terapeutice remarcabile cum ar fi efectul hipogliceminat, antioxidant, antimicrobian, de inhibiţie a proliferării maligne, antiflogistic şi antipiretic, imunostimulator, miorelaxant, anticoagulant, etc. Experimentele s-au desfăşurat pe şobolani albi, linia Wistar şi şoareci Swiss şi NMRI. Administrarea extractului de Peucedanum sp. s-a făcut prin sondaj buco-esofagian realizat la şobolani cu ajutorul unui cateter urinar pentru pisici lubrifiat, iar în cazul şoarecilor cu ajutorul unei branule de uz uman. Au fost efectuate determinări hematologice, biochimice şi măsurarea parametrilor stresului oxidativ. Pentru toxicitatea acută, pudra de Peucedanum officinale a fost administrată în doză de 50 mg / animal la şobolan şi 10 mg / animal la şoarece, iar extractul apos e Peucedanum oreoselinum a fost administrat în doză de 5 ml/ animal la şobolan şi 1 ml / animal la şoarece (doze de 10 ori mai mari decât dozele terapeutice). Efectului ameliorator în patologia asociată scăderii nivelului estrogenic (sidromul menopausal), a fost reprodus experimental prin ovarectomie, rezultatul ameliorator al extractului de Peucedanum officinale a fost evaluat prin determinări hematologice, biochimice, evaluarea parametrilor stresului oxidativ, măsurarea masei corporale, a volumului uterin şi a densităţii osoase. Evaluarea efectului antitumoral, a fost realizată prin inocularea experimentală a carcinomului ascitic Ehlich la şoareci, evaluându-se volumul şi concentraţia celulară a lichidului ascitic. Efectul antiinflamator a fost evidenţiat pe modelul experimental al edemului labei la şobolan prin injectarea intraplantară de caolin în ţesutul plantar al labei posterioare (măsurătorile au fost efectuate prin pletismografie). Testele de toxicitate nu au arătat efecte adverse, toate animale luate în studiu au trăit până la sfârşitul experimentului, neprezentând nici un semn clinic, examenele hematologice şi biochimice sanguine nu au relevat anormalităţi. În cazul osteoporozei experimentale, leucograma nu a prezentat modificări între loturile luate în studiu, leucocitele, hematiile (cu toate constantele eritrocitare) şi trombocitele fiind în valori normale şi foarte apropiate între toate loturile luate în studiu. Administrarea extractului a redus semnificativ această creştere, nivelurile fiind mai scăzute chiar în comparaţie cu lotul martor. Componentele biochimice sanguine, nu au prezentat deviaţii notabile de la normal, fiind apropiate de lotul martor, şi în limitele normale ale speciei, doar fosfataza alcalină a fost crescută la lotul supus ovarectomiei, faţă de lotul martor. Densitatea osoasă, a prezentat scăderi faţă de lotul martor, atât tibia cât şi femurul prezentând densităţi reduse faţă de lotul martor. Densitatea este mai mare la lotul tratat cu Peucedanum officinale cu toate acestea diferenţele nu au acoperire statistică. O creştere marcantă şi omogenă a greutăţii corporale se remarcă numai la loturile supuse ovarectomiei, administrarea de Peucedanum nu pare să influenţeze creşterea corporală. Ovarectomia este însoţită de o scădere marcantă volumului uterin, extractul de Peucedanum nu diminuează cu nimic nivelul involuţiei uterine. Deşi volumul tumoral şi concentraţia celulară a lichidului recoltat de al lotul tratat cu Peucedanum oreoselinum este mai redus decât în cazul lotul care a primit doar alcool totuşi diferenţele nu au acoperire statistică. Efectul antioxidant a fost evident indivizii supuşi terapiei prezentând un nivel mai scăzut al malonildialdehidei. Edemul labei s-a dovedit a fi o metodă eficientă de evidenţiere a acţiunii antiinflamatorii a extractului de Peucedanum , efect reflectat de o inhibiţie a edemului cu o valoare maximă la 4 h, la fel ca şi în cazul majorităţii medicaţiei antiinflamatorii, dar efectul a fost evidenţiat în toate determinările efectuate. Diferenţele faţă de lotul martor negativ a fost relevantă în toate determinările. Modele experimentale din studiul de faţă au dovedit pentru ambele specii luate în studiu (P. officinale şi P. oreoselinum) un semnificativ efect antioxidant, iar pentru extractul de Peucedanum officinale un cert efect antiinflamator. Aceste descoperiri creează premisele omologării unor produse fitofarmaceutice cu rol în ameliorarea afecţiunilor inflamatorii acute sau cronice, sau altor maladii asociate cu stresul oxidativ.
Anul 2008
Etapa VIII Inducerea embriogenezei somatice la specii oficinale de Peucedanum si criostocarea lor; evidenţierea diversităţii intraspecifice (polimorfism genetic) în cadrul unor populaţii de Peucedanum din Transilvania cu un conţinut ridicat de principii active Faza executată de către Conducatorul de Proiect – Institutul de Cercetari Biologice, Cluj-Napoca si de catre Partenerul 6 ICAS Bucuresti
Embriogeneza somatica a fost indusa in cazul ambelor specii Peucedanum oreoselinum si P. longifolium atat direct cat si indirect. Embriogeneza somatica directa a fost indusa, fara etapa intermediara de calus, din diferite explante (radacina, petiol, limbul frunzei) prelevate din plantule dezvoltate aseptic de Peucedanum oreoselinum si P. longifolium (de cca 15 zile) si cultivate pe mediul MS (Murashige-Skoog, 1962) cu 2,4 –D (4,5 μM) si prolina (5 mM), atunci cand culturile au fost mentinute la intuneric pe o perioada de 4-5 saptamani. Dupa transferal explantelor pe medii lipsite de hormoni, si mentinute la lumina, pe suprafata explantelor apar in primele zile, sub forma de protuberante, embrioni somatici in stadiul incipient preglobular. Pentru trecerea lor spre celelalte stadii de dezvoltare ale embrionilor somatici – globular, cordiform, torpila si cotiledonar, explantele au fost mentinute in continuare pe acelasi tip de mediu MS lipsit de regulatori de crestere vegetali la un regim de lumina/intuneric (16/8 ore pe zi). Numarul cel mai mare de embrioni somatici s-a obtinut, indiferent de specie, din explantele prelevate din radacini. Aceste medii lipsite de hormoni s-au dovedit favorabile si pentru regenerarea plantulelor. In cazul embriogenezei indirecte, via calus, s-a observat faptul ca in cazul ambelor specii cel mai bine au reactionat explantele prelevate din radacini. Aceste calusuri embriogene obtinute in aceleasi conditii (pe mediul MS cu 2,4-D si prolina), au fost trecute, pentru dezvoltarea embrionilor somatici, tot pe medii lipsite de fitoregulatori, embrionii somatici parcurgand aceleasi stadii descrise mai sus. Pentru inducerea suspensiilor celulare embriogene, calusurile embriogene friabile au fost transferate in medii lichide. Dupa mai multe subcultivari succesive pe acelasi tip de mediu (MS cu 2,4-D) s-au obtinut suspensii celulare embriogene care au fost filtrate prin site metalice, iar agregatele ramase pe ele au fost transferate in medii lichide lipsite de fitoregulatori, in aceste medii avand loc dediferentierea agregatelor proembriogene in embrioni somatici. In aceste conditii s-a determinat si durata optima de cultura in care embrionii somatici apti de germinare (aflati in stadiul de torpila si cotiledonar) sunt in proportia cea mai mare (dupa 14 zile de cultura). Acesti embrioni somatici, transferati pe medii solidificate cu agar au dat nastere la plantule normal conformate. Comparand rezultatele obtinute prin utilizarea celor trei metode privind embriogeneza somatica, si, anume, embriogeneza somatica directa, indirecta – via calus, si indirecta – via suspensii celulare, s-a constatat ca in cazul celei din urma s-a obtinut numarul cel mai mare de embrioni somatici capabili de germinare si deci de conversie in plantule per volum de cultura (peste 2000 de embrioni somatici/25 ml). Embrionii somatici de Peucedanum longifolium aflati in stadiul de torpila sau cotiledonar, indiferent prin ce metoda au fost obtinuti, au fost utilizati si pentru experimentele de crioconservare. Dintre metodele testate, cea mai eficeienta s-a dovedit metoda incapsularii-deshidratarii care a constat din inglobarea embrionilor somatici in capsule de alginat de calciu. Acestea au fost deshidratate in flux laminar de aer steril si criocongelate in azot lichid pentru o durata de o ora. Dupa decongelare, capsulele au fost transferate in medii gelifiate cu agar, in scopul urmaririi capacitatii embrionilor crioconservati de a regenera in plantule normal conformate. In urma acestor experimente s-a constatat ca rata de supravietuire a acestora, precum si aceea de a da nastere la plantule normal conformate a depins in majoritatea cazurilor de continutul in apa al capsulelor, dupa deshidratarea lor, rata maxima de supravieturire (66%) si regenerare (46%) obtinandu-se din embrionii somatici incapsulati si deshidratati pana la un continut in apa de cca 24%. In ceea ce priveste stabilitatea genetica a plantulelor regenerate din embrionii somatici criocongelati, analizele RAPD au relevat faptul ca nu exista nici o diferenta genetica intre plantulele dezvoltate din seminte, si cele dezvoltate din embrionii somatici incapsulati, deshidratati si criocongelati la -196oC. Cercetările de genetică moleculară au fost realizate la 11 specii din cadrul genului Peucedanum şi au urmărit identificarea unor markeri moleculari pentru caracterizarea diversităţii genetice interspecifice în cadrul genului. Variabilitatea genetică a fost caracterizată cu ajutorul markerilor moleculari cloroplastici. Singurii markeri moleculari relevanţi în descrierea variabilităţii intraspecifice au fost secvenţele simple repetitive (SSR) din genomul cloroplastic. Au fost studiate 6 zone caracterizate distincte ale genomului cloroplastic, patru dintre aceste prezentând polimorfim. Dintre acestea, în descrierea haplotipurilor au fost utilizate doar trei zone, caracterizate de primerii ccmp2, ccmp3 şi ccmp4, a patra zonă prezentând un polimorfism foarte accentuat, care caracterizează mai mult diversitatea intraspecifică şi intrapopulaţională decât pe cea interspecifică. Deoarece, în cazul unor specii de Peucedanum, a fost analizat un singur exemplar, pentru stabilirea cu precizie a haplotipurilor şi evidenţierea diversităţii inter- şi intraspecifice este necesară analizarea a minim câte 5 exemplare din cel puţin două populaţii distincte. Ca rezultat al cercetărilor s-a reuşit cartografierea distribuţiei diversităţii genetice la nivel naţional pentru cele 11 specii de Peucedanum sp. Şi a fost realizată o bază de date în sistem GIS, în care sunt identificate principalele caracteristici ale populaţiilor studiate: localizare geografică, număr de exemplare studiate, variabilitatea genetică la nivel indivicual. De asemenea au fost stabilite distanţele genetice dintre specii, precum şi caracteristicile moleculare ale speciilor în cadrul genului. Cele mai bine definite specii, din punctul de vedere al caracteristicilor moleculare sunt: P. palustre, P. cervaria şi P oreoselinum. O constanţă ridicată din punct de vedere molecular o au şi specii de P. officinale şi P. longifolium. Speciile mai sus menţionate pot fi identificate cu uşurinţă şi precizie prin markeri moleculari stabiliţi în cadrul proiectului. Analiza comparativă a rezultatelor de genetică moleculară şi celor de biochimice arată o corelaţie evidentă între structura genetică a speciilor şi conţinut ridicat de furanocumarine, substanţe cu proprietăţi fotosensibilizante şi citostatice. Speciile cele mai bogate în substanţe având principii active sunt P. longifolia şi P. officinale, specii foarte apropiate din punct de vedere al structurilor genetice şi care pot fi caracterizate prin markeri moleculari distincţi faţă celelalte specii analizate din cadrul genului. Lunand in considerare toate rezultatele obtinute, putem confirma cu certitudine ca toate obiectivele si activitatile prevazute in cadrul acestei etape au fost realizate pe deplin
Etapa IX Caracterizarea diversităţii enzimatice la speciile de Peucedanum din Transilvania cu un conţinut ridicat de principii active; Obţinerea şi caracterizarea a 2-3 extracte farmaceutice valoroase din specii de Peucedanum din Transilvania care sunt solicitate pentru valorificare de unele firme interesate Faza executată de către Conducatorul de Proiect – Institutul de Cercetari Biologice, Cluj-Napoca, Partenerul 3 UMF „Iuliu Hatieganu” Fac. De Farmacie, Cluj-Napoca si Partenerul 4 UBB, Fac. de Biologie-Geologie, Cluj-Napoca
Exprimarea izoeproxidazelor este slabă, dar pe baza celor evidenţiate s-a putut observa un nivel mare de polimorfism intrapopulaţional al speciilor de Peucedanum. Polimorfismul interpopulaţional nu este mare. Au fost evidenţiate diferenţe notabile între speciile de Peucedanum analizate. Se poate spune că speciile de P. carvifolium, P. cervaria, P. latifolium şi P. officinalis prezintă un pattern extrem de asemănător, exprimând în general izoperoxidaza foarte alcalină. P. austriacum, P. palustre, P. tauricum şi P. oreoselinum prezintă doar două izoperoxidaze, una slab-alcalină şi alta slab acidă. P. oreoselinum şi P. rochelianum mai prezintă izoperoxidaze şi în regiunea acidă de pH. P. oreoselinum face legatura între speciile de Peucedanum ce prezintă doar izoperoxidaze alcaline şi slab-alcaline şi speciile de Peucedanum ce prezintă şi izoperoxidaze acide. Exprimarea izoestarezelor este foarte bună, cu ajutorul acestora s-au putut evidenţia grupuri de specii cu patternuri similare. Astfel, speciile P. carvifolium şi P. cervaria, prezintă patternuri ale izoesterazelor aproape identice. Speciile P. latifolium, P. austriacum şi P. oreoselinum reprezintă un alt grup de specii cu patternuri asemănătoare şi complet diferite de grupul descris anterior. Speciile P. officinalis şi P. rochelianum reprezintă un alt grup distinct de celelalte, iar specia P. tauricum prezintă un pattern al izoesterazelor complet diferit de cel al celorlalte specii descrise anterior. Cea mai mare variabilitate intrapopulaţională a fost evidenţiată la P. oreoselinum.
Marea variabilitate ce există între speciile de Peucedanum analizate este corelată şi cu caracterele morfologice, în special cu anatomia frunzei. Există o mare varietate de tipuri de frunze la speciile de Peucedanum.
Pentru valorificarea terapeutică s-au selecţionat 2 specii de Peucedanum din Transilvania: P. oreoselinum (L.) Moench., pătrunjelul de câmp şi P. officinale L., chimionul porcului. Pentru P. oreoselinum s-a utilizat partea aeriană a plantei (herba) recoltată înainte de înflorire, din care am obţinut un extract fluid (1:1) iar din acesta extractul uscat (3:1) şi capsule operculate cu 0,25 g extract uscat. S-au caracterizat fizico-chimic cele 3 produs farmaceutice. S-a analizat calitativ şi cantitativ flavonoidele din cele 3 produse şi s-a standardizat extractul uscat în 1,60% flavonoide totale exprimate în rutozidă. S-au izolat furanocumarinele din rădăcinile de P. officinale cu un randament de 6,62% pe care le-am caracterizat prin analize CSS şi HPLC/MS. Cele două produse pot fi testate clinic în afecţiuni urologice respectiv ca citostatice.
Realizarea celor 3 preparate: uscat şi capsule operculate (caracterizate d.p.d.v. fizico-chimic) obţinute din P. oreoselinum si bogate in flavonoide, vor trebui studiate clinic în vederea introducerii lor în terapia unor afectiuni aşa cum este enuriazisul la copii, sau a altor afecţiuni urologice. De aemenea vor trebui studiate clinic furanocumarinele izolate din P. officinale, avand in vedere multitudinea efectelor pe care le au acestea – anticoagulante, vasodilatatoare, oestrogenice, fotosensibilizante ale dermei, antimicrobiene, antioxidante, anti-HIV, antihelmintice, sedative şi hipnotice, analgezice, hipotermice, citostatice şi antitumorale, principalii beneficiari fiind pacienţii, medicii umani şi spitalele, oferind astfel noi alternative terapeutice cu privire la tratamentul acestor afectiuni, şi, de asemenea, reducând costurile legate de tratarea pacienţilor, optimizând totodată reintegrarea socială şi economică rapidă a acestor pacienţi
PUBLICAŢII
Cărţi
Deliu, C., Halmagyi,A., 2008 – Embriogeneza somatica. Ed. TODESCO, Cluj-Napoca, ISBN: 978-973-7695-30-7, 257 pag
Articole
Tămaş, M., Balica, G., Crişan, G., Ştefănescu, C., Coldea, G., Deliu, C., 2007, The analysis of flavonoids and furanocoumarins of Peucedanum species from Transilvania. RBS INCDSB Bucuresti, 5, 130-131 (2007)
Sevastre, B. O., Vostinaru, C. M., Marcus, I., Tamas, M., and C. Deliu. (2007). Antiinflammatory activity of Peucedanum officinale on rats. Bulletin USAMV – CN; (64):295-298 (2007). ISSN 1843-5270
Gille, E., Tebrencu, C., Gatea, F., Ionescu E., Danila, D., 2007 – Caracterizarea prin HPCL a unor extracte standardizate utilizabile in formule de fitopreparate. Romanian Biological Sciences (RBS), vol. 5, no. 1-2, 49-51 (2007)
Eugenia Teodor, Florentina Gatea, G.L. Radu, 2007, Tehnici analitice de extractie si caracterizare a acidului hialuronic”, “Tehnici experimentale in bioanaliza”, Editura Printech, Bucuresti, pg 99-127 (2007)
Deliu, C., Coldea, G.H., Keul, M., Halmagyi A.., Coste A., Tămaş, M., Balica G.., Radu, G.L., Bârsan C., Gille E., 2008, Ecological, morphophysiological and biochemical characterization of Peucedanum species from Transylvania. Romanian Biological Sciences, Vol.XXX, No.xxx (2008)
Sevastre B., F. Lucian, Iulia Prodan, I. Marcus, M. Tămaş and C. Deliu, Peucedanum oreoselinum L. Moench effect in Ehrlich Ascitic Carcinoma. Buletin USAMV-CN, 65 (1-2)/2008 ISSN 1454-2382
Oltean B., Coste Ana, Halmagyi Adela, C. Deliu, 2008, Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf, petiol and root cultures of Peucedanum oreoselinum. Data spre publicat la revista “In Vitro”
8. Sevastre B., Iulia Prodan, Nicoleta Decea, I. Marcus, M. Tamas and C. Deliu. (2008). Peucedanum officinale prevents oxidative damage in ovariectomisated rats. Sibiul Medical 19 (2) 130-135. ISSN 1221-2873
Participări la simpozioane
Simpozionul “Plante Medicinale – Prezent şi Perspective” Editia X, Piatra Neamţ, 6-8 iunie 2007
Tămaş, M., Balica, G., Crişan, G., Ştefănescu, C., Coldea, G., Deliu, C., 2007, The analysis of flavonoids and furanocoumarins of Peucedanum species from Transilvania. Poster
Simpozionul ”Perspective in biotehnologia romaneasca sustinute prin rezultatele obtinute in cadrul Programului CEEX – BIOTECH Modulul 1”- Cluj-Napoca 24-26 oct.2007
Deliu, C., Coldea, Gh., Keul, M., Halmagyi, A., Coste, A., Tămaş, M., Balica, G., Radu, G.L., Bârsan, C., Gille, E., Caracterizarea ecologică, morfo-fiziologică şi biochimică a speciilor de Peucedanum din Transilvania. Sustinere in plen
Al XXXII -lea Simpozion Actualitati in cresterea si patologia animalelor domestice” Cluj Napoca 21-23 Octombrie 2006.
Sevastre, B. O., Vostinaru, C. M., Marcus, I., Tamas, M., and C. Deliu. (2007). Antiinflammatory activity of Peucedanum officinale on rats
– Sevastre B., F. Lucian, Iulia Prodan, I. Marcus, M. Tămaş and C. Deliu, 2007/2008, Peucedanum oreoselinum l. Moench effect in ehrlich ascitic carcinoma. Buletin USAMV-CN, ISSN 1454-2382, 64 pp….
– Sevastre, B., Prodan, I., Decea, N., Marcus, I., Tamas, M., Deliu, C., 2008, Peucedanum officinale antioxidant effect in ovariectomised rats. Officinal Journal of the Romanian Society of Physilogical Sciences, Fiziologia-Physiology, Vol. 18 (58), nr.2. ISSN 1223-2076, Abstract, 180, pp. 67
Al III-lea Simpozion de Etnofarmacologie cu participare internationala” Brasov 19-22 iunie 2008
Sevastre B., O. Vostinaru, Iulia Prodan, Elena Morogan, I.Marcus, Cristina Mogosan, M. Tamas and C. Deliu.,. Peucedanum protective effect in experimental menopausal syndrome. Sustinere in plen
Congress of the Romanian Society of Physiological Sciences, June 5-7, 2008, Cuj-Napoca, Romania
Sevastre, B., Prodan, I., Decea, N., Marcus, I., Tamas, M., Deliu, C., 2008, Peucedanum officinale antioxidant effect in ovariectomised rats. Sustinere in plen
Al XVII-lea Simpozion National De Culturi de Tesuturi si Celule Vegetale, Cluj-Napoca, 12.06.2008
Oltean, B., Coste, A., Halmagyi, A., Deliu, C., 2008, Inducerea embriogenezei somatice directe din explante de frunze, petiol si radacina de Peucedanum oreoselinum si P. Longifolium sustinere in plen
Al 7-lea Simp. Int. Perespective ale Agriculturii Mileniului III, 2-4 Oct., 2008 , Cluj-Napoca
Sevastre B., F. Lucian, Iulia Prodan, I. Marcus, M. Tămaş and C. Deliu, Peucedanum oreoselinum L. Moench effect in Ehrlich Ascitic Carcinoma
Al IX-lea Congres Int. De Farmacologie, Terapeutica si Toxicologie Clinica, 10-14 iunie 2008 Sibiu
Sevastre B., Iulia Prodan, Nicoleta Decea, I. Marcus, M. Tămaş and C. Deliu, Peucedanum officinale prevents oxidative damage in ovariectomisated rats